Teenage Mutant Ninja Turtles: Smash-Up é um lutador de plataforma para quatro jogadores. Durante a batalha, os jogadores tentam nocautear os oponentes esgotando sua barra de vida, jogando-os para fora do palco ou caindo em armadilhas. Cada personagem tem seu próprio conjunto de movimentos único, com muitos capazes de executar técnicas adicionais, como agarrar-se e pular de paredes. Os personagens são codificados por cores na tela por meio de um efeito de brilho opcional para ajudar os jogadores a acompanhar seu personagem. Como Super Smash Bros., o jogo apresenta muitas opções personalizáveis ??para batalhas. O jogo enfatiza a interação com o ambiente, e os estágios do jogo apresentam armadilhas, mudanças no próprio estágio e elementos interativos. Ocasionalmente, os itens aparecerão no palco para os jogadores coletarem, incluindo pizza restauradora de vida e habilidades ninja que concedem aos jogadores habilidades especiais como cuspir fogo e escudos elétricos.
Além das batalhas multijogador Battle Royal padrão, o Smash-Up oferece vários outros modos de jogo. Arcade apresenta uma breve história em que Splinter desafia as tartarugas April O'Neil e Casey Jones para um torneio, com finais únicos para cada um dos sete personagens. Survival desafia os jogadores a derrotar 100 oponentes antes que eles percam três vidas. Swap-Out permite aos jogadores escolher dois personagens e alternar entre eles à vontade na batalha. O Modo Missão exige que os jogadores concluam certos objetivos em cenários predefinidos, como atacar alvos ou derrotar um oponente dentro de um limite de tempo. O jogo também apresenta os modos Torneio e Prática, bem como minijogos adicionais e recursos multijogador online. Os jogadores podem coletar 'conchas' durante batalhas ou minijogos e usá-los para desbloquear recursos especiais, incluindo trajes de personagens adicionais, arte conceitual de várias mídias TMNT e troféus que outros jogadores podem ganhar em torneios online.